、样品rna的抽提pcr实验室
①取冻存已裂解的细胞，室温存放分钟使其彻底融解
②两相分离水相顶层的容积大约是匀浆时加入的trizol试剂的%以及融解于当中的rna
③rna沉定这时离心前不可见的rna沉定将在管底端和侧壁上形成胶状沉淀块
④rna清洗移去上清液，清洗rna沉定
混匀后，℃下离心分钟
⑤rna干躁小心吸去绝大多数乙醇溶液，使rna沉定在室温空气中干躁-分钟
⑥融解rna沉定融解rna时，先加入无rna酶的水;用枪反复吹打几次，使其彻底融解，获得的rna溶液保存于-℃待用
、rna质量检测
）紫外吸收法测定
先用稀释用的te溶液将分光光度计调零
然后取少量rna溶液用te稀释（:）后，读取其在分光光度计和处的吸收值，测定rna溶液浓度和纯净度
①浓度值测定
a下读值为表示;rna
样品rna浓度值(;)计算公式为a;稀释倍数;;
具体计算如下rna溶于;depc水中，取，:稀释至;的te中，测得a=rna浓度值=;;;=;或;;
取用来测量以后，剩余样品rna为;，剩余rna总量为;;;;=;
②纯净度检测
rna溶液的aa的比值即为rna纯净度，比值范围到
）变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶
②准备rna样品
取;rna，加倍容积的甲醛上样染液，加eb于甲醛上样染液中至终浓度值为;
加热至℃孵育分钟使样品变性
③电泳
上样前凝胶须预电泳，随后将样品加入上样孔
;v电压下，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少;
④紫外透射光下观察并拍照
rna的降解表现为核糖体rna带的弥散
用数码照相机拍下电泳结果
、样品dna合成
①反应体系
②混合液在加入逆转录酶mmlv之前先℃干浴分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶;，℃水浴分钟
③取出后立即℃干浴分钟，得到逆转录终溶液即为dna溶液，保存于-℃待用
、梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（;-）实时定量pcr
①;-阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度值为的次方，反应前取;按倍稀释（加水;并充分混匀）为的次方，依次稀释至的次方、的次方、的次方、的次方、的次方、的次方，以备用
②反应体系如下
标准品反应体系
序号反应物剂量
sybrg染料;
阳性模板上游引物f;
阳性模板下游引物r;
ntp;
t酶;
阳性模板dna;
ho;
总容积;
轻弹管底将溶液混合，短暂离心
管家基因反应体系
序号反应物剂量
sybrg染料;
内参照上游引物f;
内参照下游引物r;
ntp;
t酶;
待测样品dna;
ho;
总容积;
轻弹管底将溶液混合，短暂离心
③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为℃分钟，然后℃分钟，℃分钟，共个循环
、制备用于绘制梯度稀释标准曲线的dna模板
①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的dna模板进行pcr反应
反应体系
序号反应物剂量
cr缓冲液
mc溶液
上游引物f
下游引物r
ntp混合液
t聚合酶
dna
加水至总容积为
轻弹管底将溶液混合，短暂离心
个pcr循环（℃分钟；℃分钟；℃分钟）；;c延伸分钟
②pcr生成物与dnal在％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测pcr生成物是否为单一特异性扩增条带
③将pcr生成物进行倍梯度稀释:将pcr生成物进行倍梯度稀释:设定pcr生成物浓度值为;，依次稀释至、、、、、几个浓度梯度
、待测样品的待测基因实时定量pcr
①所有dna样品分別配置实时定量pcr反应体系
体系配置如下
序号反应物剂量
sybrg染料
上游引物
下游引物
ntp
t聚合酶
待测样品dna
ho
总容积
轻弹管底将溶液混合，短暂离心
②将配制好的pcr反应溶液置于rpcr仪上进行pcr扩增反应
反应条件为℃分钟预变性，然后按℃分钟，℃分钟，℃分钟，共做个循环，最后℃分钟延伸
、实时定量pcr使用引物列表
引物设计软件pp，并遵循以下原则引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发dna聚合反应(即错配)
、电泳
各样品的目的基因和管家基因分別进行rpcr反应
pcr生成物与dnal在％琼脂糖凝胶电泳，gv;染色，检测pcr生成物是否为单一特异性扩增条带